Western Blotting Parte I: Electroforesis

El western blott o inmunoblott es un inmunoensayo en el cuál anticuerpos específicos son utilizados como sondas marcadas. Esta técnica permite comparar la abundancia de las proteínas separadas por electroforesis en gel, utilizando carriles distintos para cada una de las muestras.

La técnica puede dividirse en 5 pasos

• Electroforesis
• Blotting
• Inmunodetección
• Imagen
• Análisis (Cuantificación)

Electroforesis

Cualquier molécula cargada en solución, migrará en un campo eléctrico aplicado, un fenómeno conocido como electroforesis. La velocidad de migración dependerá del campo eléctrico y de la densidad de carga de la molécula, esto es, la relación de masa/carga. Debido a que las proteínas disueltas tienen una carga neta, una solución que contiene una mezcla de proteínas, puede en teoría ser resuelta por una electroforesis, dado que las proteínas distintas con densidades de carga diferentes, migran hacia los electrodos apropiados a diferentes velocidades, sin embargo una separación efectiva nunca se alcanza dado que todas las proteínas están inicialmente distribuídas en la solución. La respuesta a este problema, es cargar la solución de proteínas en un amortiguador (buffer), permitiendo que las proteínas con densidades de carga distintas migren a zonas discretas.

La electroforesis puede ser de una sola dimensión (p.e un solo plano de separación) o de dos dimensiones, la separación bidimensional de proteínas puede ser utilizada para resolver todas las proteínas de una célula.

Si las proteías se separan en un gel de poliacrilamida el procedimiento es abreviado como SDS-PAGE (para Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electroforesis).

Los geles de poliacrilamida son formados por la polimerización de dos compuestos, la Acrilamida y la N-N-metilenbisacrilamida (o para abreviar Bis). Bis es un agente de anclaje cruzado (más cross linking) para los geles. La polimerización es inicada por la adición de persulfato de amonio junto con DMAP o TEMED. Los geles son redes tridimensionales, neutras e hidrofílicas de hidrocarburos largos entrecruzados por grupos metileno.

La separación de las moléculas dentro del gel es determinada por el tamaño de los poros formados en el gel. El tamaño del poro es determinado por dos factores: - La cantidad total de acrilamida presente designada como %T. - La proporción del agente de entrcruzamiento (cross linker). Conforme aumenta la cantidad de acrilamida presente, disminuye el temaño del poro. Los geles se determinan como soluciones en porcentaje y tienen dos parámetros necesarios. El total de acrilamida es dado como porcentaje (w/v) de acrilamida más la bis-acrilamida.

Regla de oro: Mientras más pequeña sea la proteína de interés, deberá ser mayor el porcentaje de mono/bis. Mientras más grande la proteína de interés, menor será el porcentaje mono/bis.

Nota: La acrilamida es una potente neurotoxina acumulativa: utilize guantes todo el tiempo. Coloque los geles en el tanque de electroforesis como lo indica el fabricante bañado en buffer.